納米孔單分子檢測技術(shù)于30年前被提出并得到快速的發(fā)展，基于納米孔的DNA測序商品儀器已問世多年。目前，研究人員正拓展該技術(shù)用于蛋白質(zhì)/多肽識別、miRNA檢測、酶活性鑒定、分子構(gòu)象識別等領(lǐng)域。生物納米孔就是一個由氨基酸有序排列組成的蛋白質(zhì)分子的納米孔道，目標(biāo)分子進(jìn)入納米孔道時將誘導(dǎo)時序性的離子流變化，從而獲取孔道內(nèi)部單個分子的信息，因此，孔道內(nèi)的離子流變化是納米孔道傳感的基礎(chǔ)與核心，并實(shí)質(zhì)上決定了納米孔道的傳感靈敏度及其應(yīng)用范圍。待測分子誘導(dǎo)的離子流阻斷通常被認(rèn)為主要由其在納米孔道內(nèi)排開溶液體積造成，然而，實(shí)驗(yàn)中頻繁出現(xiàn)的離子流阻斷與排阻體積的不一致性時常困擾著研究者;同時，現(xiàn)有的對孔道內(nèi)離子流阻斷的這一理解也限制了該技術(shù)在單分子蛋白質(zhì)測序、復(fù)雜體系中生物標(biāo)志物識別中的應(yīng)用和發(fā)展。因此，對納米孔道內(nèi)離子流傳感信號重新從電化學(xué)源頭認(rèn)識至關(guān)重要。

圖1. 相互作用決定單個甲基差異誘導(dǎo)Aerolysin納米孔道內(nèi)離子流阻斷增強(qiáng)

近日，南京大學(xué)研究院生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室龍億濤課題組重新審視并提出了納米孔道內(nèi)離子流傳感的來源：待測物在孔道內(nèi)的排阻體積與其和孔道之間的相互作用協(xié)同決定了離子流信號的特征。該工作首先從理論角度揭示了納米孔道與目標(biāo)分子之間的非共價相互作用，包括靜電相互作用、范德華相互作用、氫鍵等通過影響孔道內(nèi)的離子遷移率，從而改變孔道內(nèi)未被目標(biāo)分子占位部分的溶液電導(dǎo)，以乘積的形式在體積排阻的基礎(chǔ)上誘導(dǎo)離子流傳感信號的增強(qiáng)。同時，在實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方面，基于單個甲基差異的DNA片段在Aerolysin生物納米孔道中誘導(dǎo)的增強(qiáng)的離子流信號，結(jié)合溶液電導(dǎo)理論和納米孔道實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了甲基化DNA與Aerolysin的相互作用在增強(qiáng)離子流信號中的重要性，并對其在離子流信號增強(qiáng)中的貢獻(xiàn)進(jìn)行了定量化。

圖2. 分子動力學(xué)模擬揭示相互作用差異

通過分子動力學(xué)模擬，進(jìn)一步揭示了Aerolysin識別甲基化DNA/正常DNA的主要區(qū)域，證明了其與甲基化DNA/正常DNA差異的相互作用，并通過具體解析孔道內(nèi)各個氨基酸位點(diǎn)與DNA的各種非共價相互作用，提出了Aerolysin基于相互作用識別DNA上單個甲基基團(tuán)的機(jī)制。同時，通過巧妙設(shè)計Aerolysin上的突變以定向調(diào)控非共價相互作用類型及大小，證實(shí)了非共價相互作用協(xié)同體積排阻對離子流信號的”倍增”效應(yīng)。

圖3. 定向設(shè)計特定氨基酸相互作用調(diào)控識別能力

該研究成果以“Revisiting the Origin of Nanopore Current Blockage for Volume Difference Sensing at the Atomic Level”為題，發(fā)表于JACS Au(DOI：10.1021/jacsau.1c00109，文章鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacsau.1c00109), 南京大學(xué)化學(xué)和生物醫(yī)藥創(chuàng)新研究院的博士后李孟寅為論文第一作者，龍億濤教授為通訊作者。此項(xiàng)研究得到了國家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目“基于納米孔道電荷傳輸?shù)膯畏肿訂渭?xì)胞精準(zhǔn)測量”和中國博士后科學(xué)基金等經(jīng)費(fèi)資助。