近日，武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院李誠予副教授在CRISPR/Cas12a生物傳感器的構(gòu)建方面取得階段性進展，研究成果“A boosting upconversion luminescent resonance energy transfer and biomimetic periodic chip integrated CRISPR/Cas12a biosensor for functional DNA regulated transduction of non-nucleic acid target”發(fā)表于SCI一區(qū)期刊《Biosensors and Bioelectronics》上。

近年來，基于Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) 的基因編輯技術(shù)受到了科學(xué)界的廣泛關(guān)注。這項革命性技術(shù)的靈感是來源于細菌和病毒在生命進化歷史上進行斗爭所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答模式。簡單來說，就是病毒能把自己的基因整合到細菌內(nèi)，利用細菌的細胞工具為自己的基因復(fù)制服務(wù)，而細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR系統(tǒng)。利用這個系統(tǒng)，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除。

由于CRISPR系統(tǒng)需要核酸酶(Cas蛋白)結(jié)合一段引導(dǎo)RNA(CrRNA)來實現(xiàn)目標(biāo)核酸的特異性識別，因此該技術(shù)在實際操作過程中具有很高的精準(zhǔn)度。相比于早期發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，近年來新發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas12a系統(tǒng)不僅具備CRISPR/Cas9的cis cleavage功能，還可實現(xiàn)一種特殊的trans cleavage效應(yīng)，即額外對任意“非目標(biāo)”核酸序列進行切割。

近期，借助CRISPR/Cas12a優(yōu)異的目標(biāo)物識別精準(zhǔn)度以及trans cleavage能力，研究人員基于電化學(xué)、比色、熒光等分析平臺構(gòu)建了一系列的生物傳感器，其中熒光分析受到更為廣泛的關(guān)注。但是，由于缺少有效的目標(biāo)物轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，目前所報道的CRISPR/Cas12a傳感器都只能用于單純核酸的檢測。為進一步擴大分析物的范圍，李誠予副教授在本工作中將“功能化DNA”這一概念引入CRISPR/Cas12a系統(tǒng)以實現(xiàn)對非核酸目標(biāo)物的轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過將適配體和DNAzyme作為功能化DNA，上述CRISPR/Cas12a傳感器可有效對模型目標(biāo)物ATP和Na+分別進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

由于目前所構(gòu)建的CRISPR/Cas12a熒光生物傳感器都是基于傳統(tǒng)的斯托克斯熒光發(fā)射模式(可見光激發(fā))，因此它們在復(fù)雜生物樣本(如細胞提取液，人體體液)中仍存在挑戰(zhàn)。為解決這一問題，李誠予副教授將“基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光的發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(LRET)”這一檢測模式進一步引入到CRISPR/Cas12a系統(tǒng)中。由于上轉(zhuǎn)換納米顆粒(UCNP)的尺寸較大(一般> 20 nm), 將UCNP作為能量供體的LRET體系存在能量轉(zhuǎn)移效率很低(一般< 50%)這一瓶頸。李誠予副教授在本工作中構(gòu)建了一種“能量集中”型UCNP，即通過構(gòu)建一種“三明治”結(jié)構(gòu)的UCNP，將上轉(zhuǎn)換發(fā)光區(qū)域極大地局限于一個很窄的內(nèi)殼層內(nèi)(~ 2.5 nm)。基于以上設(shè)計理念，上述改進的UCNP對其表面所偶聯(lián)的報道DNA(修飾有BHQ-1分子)的能量轉(zhuǎn)移效率可被顯著提升至92.9%。

“能量集中”型UCNP與仿生周期芯片相結(jié)合的針對非核酸目標(biāo)物的CRISPR/Cas12a生物傳感器原理圖

為進一步提升分析靈敏度并同時實現(xiàn)“即使檢測”，李誠予隨后將上述傳感體系負載于一種特殊的“仿生”周期芯片當(dāng)中。通過選用光子晶體作為信號放大器與芯片界面，上述上轉(zhuǎn)換發(fā)光強度可被大幅提升35倍。同時，該傳感器可在便攜式手持980 nm激光器的照射下，通過手機拍照這一簡單的方式來進行定量檢測，對ATP和Na+的檢出限可分別低至18 nM和0.37 μM，并具有很好的特異性。此外，該方法不僅可有效對單細胞水平內(nèi)的ATP含量變化進行動態(tài)監(jiān)測，還可準(zhǔn)確分析低血鈉患者中的血漿鈉含量。